质粒构建-质粒构建流程

摘要： 本文目录一览：1、构建质粒长度15000bp难不难2、质粒载体的构建步骤...

本文目录一览：

• 1、构建质粒长度15000bp难不难
• 2、质粒载体的构建步骤
• 3、构建重组质粒必须使用哪两种酶
• 4、杆状病毒质粒构建步骤
• 5、质粒构建的引物是什么
• 6、克隆和质粒构建是做什么的

构建质粒长度15000bp难不难

1、是的。这个质粒用的是PSC101质粒的***子（pSC101ori+Rep101蛋白，加上前后富余的序列共1500bp长），抗性基因截取了pUC19的AmpR基因区（长度约1100bp）。

2、bp不算长，而且还是质粒模板，常规的就能扩增出来。主要还是要注意引物的设计，其Tm值和GC含量，还有就是该片段的GC含量，如果太高可以加点DMSO。剩下的关于酶之类的条件一般说明书上都有，仔细看看。

3、*Phanta max master mix：25ul R：2ul（10uM） F：2ul（10uM） cDNA：21ul（稀释过的）95℃ 3min 95℃ 15s 60℃ 15s 72℃ 1000bp/min (2-4步30个循坏，不能多。

4、一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。

5、有可能，不过这要看你载体和目的片段两端的酶切位点。如果是相同的末端或者末端是平末端，那就很有可能多段连接。至于能不能正常表达，还要看你连接的顺序等问题。要看promoter的位置。

6、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。保护碱基数目的问题。

质粒载体的构建步骤

1、p2：此步为碱处理。其中NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。

2、通过PCR扩增目的基因片段 PCR要设计引物，设计引物时要选择合适的同源序列，根据质粒载体和基因序列要选择合适的酶切位点，PCR的产物要纯化。

3、载体技术则是把质粒转移到另一种有定位作用的目标载体上，这样就可以准确选择和组装基因。

构建重组质粒必须使用哪两种酶

过程：首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。

复杂的双酶切操作可以用T载体连接，目的基因只需用合适的Taq酶PCR就足够，自然会留下A末端去连接载体上的T末端。如果是Gibson法一类的无缝重组法，目的基因也不需要切，只需要两端同源或者特定序列足够就行。

先用限制酶分别处理目的基因和运载体，使之露出相同的黏性末端；将切下的目的基因的片段插入到质粒切口处，再用DNA连接酶将处理好的目的基因和运载体的黏性末端接好，就完成了基因的重组。

杆状病毒质粒构建步骤

1、此外，在构建质粒过程中，还会加入一些酶，比如胞嘧啶去氧核糖核酸酶等，来有效促进和加强***过程中质粒，协助把***后的DN段定位与模板DNA上，形成可合成的质粒。

2、通过PCR扩增目的基因片段 PCR要设计引物，设计引物时要选择合适的同源序列，根据质粒载体和基因序列要选择合适的酶切位点，PCR的产物要纯化。

3、（1）根据你已知的序列设计带有酶切位点的引物。（2）PCR，跑胶，看看你的目的条带大小对不。（3）条带对的话再重新跑个大孔胶，然后切胶回收。

质粒构建的引物是什么

1、这个时候设计出来，用于完成PCR扩增，并能够在目标序列上下游都引入酶切位点的两段序列就叫做质粒构建引物。

2、质粒形成技术是一种以DNA结合胞嘧啶为主的构建技术，大体来说，它主要是把所需要的基因引物酶及基因改造材料结合在一起形成质粒。载体技术则是把质粒转移到另一种有定位作用的目标载体上，这样就可以准确选择和组装基因。

3、质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主***的遗***位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。

4、E.coli有很多种质粒。不同菌株具有不同的质粒。不同质粒的DNA序列不同。如果你说（完整）质粒扩增，只需要培养细菌就可以，质粒本身就可以自行***（扩增），达到扩增目的。

克隆和质粒构建是做什么的

1、同源重组构建质粒原理是广泛应用的一种分子克隆技术。

2、学习和掌握碱裂解法小量提取质粒。质粒克隆是克隆实验的一种，其实验过程繁琐，目的是为了学习和掌握碱裂解法小量提取质粒。基因克隆基因ORF或者干扰序列表达质粒是现代分子生物学常用的研究工具。

3、克隆载体：能在宿主细胞中***繁殖，而且最好要有较高的自主***能力；容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好；容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。

4、质粒在基因工程中是作为载体送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。质粒具有自主***能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。